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关于WB实验中的NC膜你知道多少?
点击次数:253 更新时间:2023-11-24

首先了解下,体外诊断原料的NC和蛋白转移的NC是有区别的:体外诊断原料的NC膜是作为核心载体原料,孔径在10-15μm,带背衬。而蛋白转移的NC膜,一般用于WB实验,孔径0.22um和0.45um,不带背衬。


其次用在免疫印迹中最常规的膜的类型是硝酸纤维素膜(NC 膜)和聚偏氟乙烯(PVDF)膜。两者主要区别:

产品                Biotrace NT 膜                FluoroTrans W PVDF 膜                
推荐货号                66485                BSP0161                
描述                纯硝酸纤维素,0.22μm                聚偏氟乙烯,0.2μm                
应用                蛋白转移
核酸检测
ELISA
               
蛋白转移
蛋白点或条印迹
免疫染色检测
               
优势                高灵敏度
低背景
               
最高的灵敏度
低背景
低 burn through
高结合力
化学品抗性
高拉伸强度
               
结合反应                疏水和静电                疏水(甲醇浸泡)                
固定方法                Western 转移点或条印迹
烤和紫外交联(用于核酸)
               
Western 转移点或条印迹                





















转印膜的免疫印迹常见问题分析与解决方案

问题                可能原因                解决方案                
没有阳性条带或很弱                抗体活性低或效价低                分装和在零下 20 度储存抗体溶液以及避免多次反复冻融。使用更高浓度的一抗。                
转膜不充分(转膜后通过凝胶染色得到了确认)                增加转膜的时间。降低转膜缓冲液中甲醇的浓度。
加入 0.1%的 SDS 能够帮助大蛋白的转膜。
               

低的偶联活性                确保胶和膜之间没有气泡。使用不含 SDS 的转膜缓冲液。如果使用的是 Biotrace NT 膜,则需在转膜缓冲液中加入甲醇                
封闭剂干扰了抗体的结合                在 4 度储存偶联物。增加偶联物的浓度或孵育时间。                
背景高                使用一个不同的封闭剂。                
抗体和酶偶联的效果差                颜色反应时间太长                当需要的颜色深度达到之后立即停止反应
               
封闭不全                使用亲和纯化的二抗。                
封闭剂中存在磷酸酶或过氧化物酶的活性                增加封闭时间。使用一个不同的封闭剂。                
背景点状物                缓冲液中存在颗粒                试剂使用前用过滤器过滤。
               
假阳性或点状                一抗的交叉反应                进一步纯化或预吸附膜抗体。如果条件可以的话使用单抗。降低一抗的浓度。                
样本中存在磷酸酶或过氧化物酶的活性(通过在检测中不加一抗和二抗得到确认)                在封闭前通过 80 度 20 分钟加热来失活酶的活性。                






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